Real-time qPCR入门知识介绍

操作方法

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  实时 PCR 就是在 PCR 扩增过程中 ，通过荧光信号，对 PCR 进程进行实时检测。一般来讲，定量 PCR 仪包括：实时荧光定量 PCR 仪主要由样品载台 、基因扩增热循环组件、微量荧光检测光学系统、微电路控制系统、计算机及应用软件组成。其中 基因扩增热循环组件工作原理与传统基因扩增仪大致相同 ，不同厂家不同型号的产品分别采用空气加热、压缩机制冷、半导体加热制冷等工作方式。独特是这个微量荧光检测系统。有由荧光激发光学部件、微量荧光检测部件、光路、控制系统组成。常用的荧光激发方式有两种：卤钨灯和 LED；荧光检测元件常用两种方式：光电倍增管和冷光 CCD 摄像机，光单色元件有滤光片和光栅。在实时 PCR 扩增过程中 ，荧光信号被收集，转化为成为扩增和熔解曲线。具体数据就是基线，荧光阈值和 Ct 值。

  
• 02

  Real-time qPCR 的数学原理：也就是说为什么 Ct 值跟初始模板的量成正比？首先来看一个 real-time qPCR 中的重要参数（具体的后面会讲到 ） Ct 值（ Ct value）， 阈值（ threshold），和基线（ baseline）。 一般来讲，第 3-15 个循环的荧光值就是基线，是由于测量的偶然误差引起的。阈值一般是基线的标准偏差的是 10 倍。在实际操作中也可以手动调节，位于指数期就可以 。 Ct 值就是荧光值达到阈值时候的 PCR循环次数。所以是一个没有单位的参数。

  
• 03

  那么为什么说 Ct 值跟初始模板的量程正比呢？？？我们来看 我们来看 PCR 的扩增方程：：

  
• 04

  从线性方程上看，斜率（ slope）为 -1/lg(1+E)，所以 E=10^-1/slope-1。如果从标准曲线上得到斜率（ -3.3）， 就可以算出扩增效率（ 0.99）。 一般来讲 PCR扩增效率在 90%-110%都是可以用于数据分析的 。效率低于 100%，是由于PCR 反应中存在抑制因素；而高于 100%可能一些污染、非特异性扩增或者是引物二聚体造成。

• 05

  Real-time qPCR 的种类:一类为探针类 包括TaqMan®探针和 分子信标，利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加。一类为非探针类，其中包括如 SYBR® Green I 或者特殊设计的引物(如 LUX®Primers) 通过荧光染料来只是产物的增加。

• 06

  Taqman®探针是最早用于定量的方法。就在 PCR 扩增时加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸：5’端标记一个报告荧光基团 ，3’端标记一个淬灭荧光基团 。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，也就是 FRET 反应 ；PCR 扩增时，Taq 酶的 5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离 ，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形 成，实现了荧光信号的累积与PCR 产物形成完全同步。而新型 TaqMan-MGB 探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP）， 有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台 。

  
• 07

  分子信标：一种在靶 DNA 不存在时形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针。在此发夹结构中 ，位于分子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团紧紧靠近。分子信标的茎环结构中 ，环一般为 15-30 个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一般 5-7 个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。荧光基团连接在茎臂的一端，而淬灭剂则连接于另一端。分子信标必须非常仔细的设计，以致于在复性温度下，模板不存在时形成茎环结构，模板存在时则与模板配对。与模板配对后，分子信标的构象改变使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，它发出自身波长的光子。

  
• 08

  SYBR® Green I 是一种结合于小沟中的双链 DNA 结合染料，与双链 DNA 结合后 ，其荧光大大增强 。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBR®GreenI 的最大吸收波长约为 497nm ，发射波长最大约为 520nm。在 PCR 反应体系中 ，加入过量 SYBR® Green 荧光染料， SYBR® Green 荧光染料特异性地掺入DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 SYBR® Green 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与 PCR 产物的增加完全同步。

  
• 09

  LUX® (light upon extention) 引物是利用荧光标记的引物实现定量的一项新技术。目标特异的引物对中的一个引物 3’端用荧光报告基团标记。在没有单链模板的情况下，该引物自身配对，形成发夹结构，使荧光淬灭。在有目标片断的时候，引物与模板配对，发夹结构打开，产生特异的荧光信号。